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ELISA 实验常见问题解析


酶免官方商城 / 2024-06-28

各个环节,可能会对最终的实验结果产生比较大的影响,比如实验出现白板,显色弱灵敏度低,花板无梯度背景高等现象。下面对以上实验现象进行一一解析。

 

1.白板现象

在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后,酶标板中所有孔的颜色均为无色,即无信号呈现。

出现该现象的可能原因:

试剂已过保质期,不同批次稀释液交叉使用。

错加漏加检测A,检测B或者底物溶液TMB。

洗板或者加样过程中,酶标记物被污染失活,稀释液中含有酶抑制剂如叠氮呐等。

配置稀释液的蒸馏水可能被污染。

洗涤液是浓缩型的,没有按比例进行稀释。

酶标记物的活性和效价比较低。

溶液的PH值不正确,一般稀释液的PH值应保持在7.2-7.4。

 

2.显色弱灵敏度低

在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后,酶标板中孔的显色比较浅,即只有微弱的信号呈现。

出现该现象的可能原因:

产品过有效期,试剂没有按规定进行适当的保存。

试剂,标准品或者样品在使用前没有平衡到室温。

少加了试剂的量或者加入试剂的稀释比例不当。

洗板或者加样过程中,酶标物受污染失活。

孵育时间和孵育温度未达到实验要求。

洗涤液稀释倍数不符合要求,洗板次数过多,洗板冲击力过大,洗板浸泡时间过长。

底物溶液TMB显色时间太短。

 

3.花板无梯度背景高

在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后,酶标板中的孔有颜色但没有梯度,背景也可能较高,。

出现该现象的可能原因:

底物溶液TMB未置于阴凉避光处保存,实验前溶液已经变蓝。

孵育温度过高或者孵育时间过长,发生了较强的非特异性吸附。

没有按说明书要求洗板,特别是洗板时洗涤液的量少加了。

加样时没有换枪头造成交叉污染。

花板现象:低浓度或者低活性的包被抗体或者检测抗体,封闭不足导致的本底不稳定,洗板不充分,包被板子的问题。

 

综上所述

ELISA实验中应注意以下问题:

1.在实验前应该按相关要求将实验试剂平衡至室温。

2.包被抗体和检测抗体应该是有高活性的且都针对同一抗原。

3.试剂保存:蛋白抗体类试剂保存于-20摄氏度,显色液洗涤液保存于2-8摄氏度。

4.各试剂在使用前应充分混匀,以保证试剂的均一性和准确性。

5.严格控制反应温度和反应试剂。

6.洗板次数,洗板液的量,洗板液浸泡时间的长短,洗板的力度都是应该注意的问题。

7.相关浓缩液应按要求稀释到相应比例方可使用,PH值要保持在7.2-7.4之间。

8.在终止反应时尽量避免微孔中存有气泡。

9.终止反应完成后应该在2min内完成酶标仪读数。

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