ELISA "一"问"一"答——样本篇

问：我能否不用推荐的收集方法来收集血浆？

答：每一次按照推荐步骤操作的测定都是经过验证可行的。在某些测定中有些抗凝剂是不被推荐的。具体请参看说明书。

有些待检测的分析物也存在于血小板中，因此，推荐使用低血小板血浆。正确的收集操作方法请参看说明书。

问：我是否可以将试剂盒中说明书的样品数据作为参考？

答：说明书中的样品数据是从有限的检测个体中得出，只能作为大概的指导。

问：我能否使用自己的稀释液或者缓冲液？

答：每个试剂盒中都含有按配方配制的与特异性样品种属相配套的稀释液，以确保待检测的样品被正确稀释。

每个试剂盒中都含有按配方配制的与特异性样品种属相配套的稀释液，以确保待检测的样品被正确稀释。

问：我是否必需按照试剂盒内说明书中的方法准备样品？

答：推荐的样品准备方法是经过实验验证的最佳的方法，所以推荐按照说明书上的方法制备样品。

问：我使用对照的检测结果都在范围外，为什么？

答：如果使用对照，其浓度应该是在某一特定范围内。如果对照值在范围外，则是无效测定。确定对照具有重复性。

问：我没有足量的稀释液去稀释所有的样品，怎么办？

答：试剂盒内提供说明书中所指定的足量的稀释液。能保证所有的标准品和样品检测两次。

如果没有推荐的稀释度，或者需要大量稀释，请在实验前计算出所需的稀释液总量，然后联系我们获取额外的稀释液。

问：我是否可以省略说明书中标准曲线的标准品值？

答：不可以。样品值必需由每次检测的标准曲线决定。

问： 如果是手绘标准曲线，我怎样决定样品浓度？

答：要决定每个样品的浓度，首先找到Y轴的光度值或者相对光单位，然后作水平线至标准曲线。在交点处，作垂线至X轴，读取相应浓度。

问： 我检测到的样品值在测定实验的动态范围之外，我是否可以用这些数值？

答：只有随标准曲线降低的样品值才被推荐使用。在标准曲线范围外的值都是非线性的，会导致错误的外推值。

如果测定的样品值比最高的标准品的值还要高，则此样品需要进一步的稀释并重新进行检测。

如果测定的样品值远低于测定范围，则样品被认为是无法被检测。

问：我的样本经不同梯度稀释，计算得到的样本浓度差异较大

答：血清样本加样量较高时，血清中的各种蛋白会抑制抗原抗体接触，稀释后，干扰蛋白也稀释，影响较小。当某两个梯度稀释后，计算得出的样本浓度接近时，则认为该稀释梯度时，样本值接近真实值。

问：标曲和样本都显色，但复孔的CV大

答：这个问题就跟移液器和实验者的操作有关了。移液器的使用维护不规范，就会造成移液的误差较大；实验者自身的操作习惯、加样的一致性对复孔的CV也有很大影响。

掌握移液器的正确使用和维护。关于个人的操作可练习移液动作、加快速度，确保移液的精密度。

问：我的本底偏高，样本值测不到

答：标曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(对于高敏ELISA可以适当放宽要求)。尤其是样本值特别低的时候，本底过高会掩盖目的信号，导致无法测到样本值。

在加入TMB显色后，需实时观察标曲显色情况。通常在S5孔有肉眼可见的微弱蓝色，即可终止反应。

问：我的标曲和样本均不显色

答：在孵育阶段静置在桌面上，这样非常不利于抗原抗体之间的充分接触，导致显色偏弱。

推荐孵育阶段，使用ELISA专用的微孔板振荡器，调至合适的频率，使抗原抗体充分接触，保证结合效果。如果排除上述原因，有可能是漏加了某个组分，如检测抗体、酶等。对于比较马虎的新手，一定要做好标记和记录，或者使用添加染料的ELISA试剂盒。

问：我的标准曲线看上去还不错，但是却没有达到我预期的结果，为什么？

答: 样品可能不含有待分析物。稀释液的影响可能遮蔽了检测。确保采用说明书推荐的稀释度。

如果确实采用的是推荐的稀释度，则检查稀释操作是否正确。过度稀释将导致样品值低于标准曲线范围。

问：我怎样补偿样品的稀释度或者浓缩度？

答：如果样品是稀释型的，标准曲线所读取的值必需乘以稀释度。

如果样品是浓缩型的，标准曲线所读取的值必需除以浓缩比。

小建议

1.确定待检测的样品在收集和制备时保证无菌操作。

2.如果要检测多个样品，将样品隔离并标记清楚以防相互污染。

3.检测前，将样品离心除去颗粒。将样品转移至新的离心管内，混合均匀。

4.在混合样品时，使用容积至少比样品体积大50%的离心管以保证混合充分。