ELISA实验中关于跳孔、信号变化的疑问及回答

一、跳孔（Drift）

◇问：我刚配置试剂的时候中断了，这是否会影响我的实验结果？

答：这可能会导致产生波动的曲线。在移液之前确定所有的标准品或者样品是否配制完好。请在试剂配制完的15-20分钟内滴加入板内。（除非特别说明） 

◇问：我是否需要一个多道移液器？

答：在配制诸如底物，酶结合物，或者稀释液的时候，最好选择连续或多道移液器。

◇问：如果我没有平衡试剂会怎样？

答：没有平衡的试剂会导致孔之间温度不均，使整个酶标板的信号产生变异。除非特别说明，试剂一般在使用之前都要平衡至室温。

每次检测都会有推荐的孵育时间和温度。冷冻的试剂一般需要更长的孵育、间。所以最好使用说明书上推荐的孵育温度和时间。

◇问：我是否需要盖板？

答：参看试剂盒内说明书。如果说明书内的实验步骤中有推荐使用盖板，则在使用时应选用与酶标板配套的盖板，使边缘与酶标板紧密契合。如果盖板的一边突起，则会产生信号的差别。

◇问：酶标仪的设置怎样影响我的结果？

答：对于底物测定，如果读数时间等于或超过2秒/孔，使从第一孔到最后一孔在读书时存在时间上的延误，会导致结果的异变。在底物反应阶段，辣根过氧化物酶会一直作用直到底物反应完全。而由于时间的延误，底物越来越少，底物反应也受到影响。将酶标仪的读数时间设定为1.0秒/孔。

◇问：我是否可以根据自己的方案来调整孵育时间？

答：更改孵育时间或温度会导致检测不能达到平衡或过度反应。请按照说明书推荐的孵育时间和温度操作。如果同时进行多项检测，对每孔必需分别计时已避免孵育不足或过度孵育。

二、信号变化（Signal Development）

信号的变化受以下几个因素影响：底物，孵育时间，酶结合物和底物反应失败，波长和仪器。

◇问：我是否可以更改底物处理的方法？

答：如果反应物溶液需要混合，确保加入的反应物试剂体积正确并充分混合。混合后的溶液必需 在15分钟内使用（化学发光检测最多4小时）。如果反应物混合得太早，则在容器中的颜色可能会发生变化。

如果底物是冻干品或片剂，则根据说明书中的方法用适当体积的稀释液将其完全溶解。混合完全后并在说明书中推荐的时间内使用。

◇问：我在移液的时候是否要按照一定的顺序？

答：根据说明书中的顺序进行移液操作。高灵敏度检测利用了放大系统。在底物孵育完成之后，按照加底物的顺序依次加入放大试剂。底物加完之后，轻拍酶标板使其充分混合。

◇问：底物有可能被污染吗？

答：是的。如果测定时使用的是碱性磷酸酶或者辣根过氧化物酶标记的结合物，在测定时要注意避免污染。污染可能会导致产生超过酶标仪范围的值。避免与金属或氧化试剂接触。使用新容器。

◇问：底物是否需要在黑暗环境中进行孵育？

答：不需要。不过在孵育过程中应避免阳光直射。

◇问：温度怎样影响结果？

答：碱性磷酸酶或者辣根过氧化物酶都是光敏感型酶。光密度单位或者相对光单位都会随着温度的改变而变化。避免在环境条件变化剧烈的地方孵育。（比如通风口，窗口这些温度和光照都剧烈变化的地方）

◇问：我是否需要校正波长？

答：对于比色法测定，需要通过校正波长来减少误差。

◇问：如果我没有校正波长应该怎么办？

答：将所读波长减去原始校正波长。这个方法可以更正光学误差。

◇问：我的酶标仪上没有说明上推荐的那种用来校正波长的滤光片，我可以用别的吗？

答：可以。只要选择的波长高于推荐的校正波长即可。

◇问：我的酶标仪没有说明书上推荐的波长，我可以用别的吗？

答：推荐波长由使用的底物和反应后颜色的峰吸收度决定。说明书上一般都有相应数据，如果没有，则选择最接近的波长。不过，这种数据变化比较大。

◇问：为什么我的相对光单位与说明书上的不一致？

答：由于工业上对于光单位的衡量没有统一的标准，所以相对光单位在酶标仪之间的变化非常大。相对光单位的数值应该具有可比性。

使用推荐的酶标仪设置，如果使用不同的酶标仪则进行相应的等值设置。不同的设置会产生不同的信号。在读数窗口准确读数。

◇问：我是按照实验步骤进行测定的，但是没有任何信号，为什么？

答：对于使用HRP底物的比色测定，终止液的加入会使底物变色。而说明书推荐的波长就是最适波长。

通过轻拍酶标板的边缘充分混合孔内试剂。加入终止液的时，颜色由蓝变黄（如果是HRP底物）。如果加终止液之前孔内试剂没有混合，则底物颜色变绿。

1.可能加入试剂的顺序错误。

2.加入底物溶液以后不要清洗酶标板。

3.在连续稀释时确定已经加入标准品。

4.如果底物系统中有两个成分，则必需混合均匀。

5.确定酶标仪的使用和操作正确。

6.确定试剂，标准品，样品都正确配制并按照说明滴加无误。

7.对于高敏感性试剂盒，确定使用的底物和放大剂都正确稀释。

◇问：引起高背景的原因有哪些？

答：1.孵育时间和温度的改变。

2.不恰当的洗涤。

3.试剂被污染。

4.孵育时酶标板被污染。

5.盖板，容器或者枪头的重复使用。