ELISA实验中标曲和样本的显色问题

ELISA实验是我们科研实验中经常使用的实验方法，看似简单其实有许多需要我们去注意的，今天就和大家介绍下实验中常见的标曲和样本的显色问题。

一、标曲不显色或显色很弱，样本显色。

溶解标准品以及倍比稀释时，未涡旋震荡或不够充分。标准品溶解时，需要涡旋震荡，以保证充分溶解。在做倍比稀释时，也要涡旋震荡以保证充分混匀。单纯依靠移液器反复吹打，效率较低、效果也不一定好。

二、标曲和样本均不显色。

在孵育阶段静置在桌面上，这样非常不利于抗原抗体之间的充分接触，导致显色偏弱。推荐孵育阶段，使用ELISA专用的微孔板振荡器，调至合适的频率，使抗原抗体充分接触，保证结合效果。

如果排除上述原因，有可能是漏加了某个组分，如检测抗体、酶等。所以在实验过程中，一定要做好标记和记录，或者使用添加染料的ELISA试剂盒。

三、标曲显色，样本不显色。

到这种情况，很多人觉得是试剂盒问题，这其实是一个误区。任何一种实验方法，都有其局限性，当样本中目的蛋白浓度极低或者样本中干扰因素较强，就无法检测到。目前ELISA仍然是蛋白检测灵敏度的方法，与不同技术结合后，衍生出了多种类型的ELISA，提高了检测灵敏度。如采用信号增强剂的高敏ELISA、ECL为底物的化学发光ELISA、采用荧光法检测的ELISA、结合PCR扩增的免疫PCR等等。

对于目的蛋白浓度特别低的样本，可以尝试用高敏ELISA，但这也并不意味着一定能检测到样本浓度，只能说可以提高样本的可测率，并使结果更加可靠。因为通常用普通ELISA检测的样本OD值都偏低，甚至低于标准品浓度的S7点，虽然可以计算得到数值，但实际上这个数值的可信度已经降低了。而高敏ELISA可提高样本OD值，使之尽量位于标曲范围内，得到的数值也更加可信。

四、标曲和样本都显色，但复孔的CV大。

这个问题就跟移液器和实验者的操作有关了。移液器的使用维护不规范，就会造成移液的误差较大。实验者自身的操作习惯、加样的一致性对复孔的CV也有很大影响。个人的操作可以在空白板上练习移液动作，或者在几十个离心管中加入相同体积的水，通过电子天平称量，检验移液的精密度。同时还需练习加快加样速度，减少从个样本到后一个样本加样时间过长导致的差异。

ELISA实验中有关标曲和样本的显色问题主要就是以上4种，当然还会存在其他的问题，在这里就不一一介绍了，大家在操作过程中要细心谨慎，防止出现以上的问题。