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ELISA实验中标曲和样本的显色问题


酶免官方商城 / 2020-12-30

ELISA实验是我们科研实验中经常使用的实验方法,看似简单其实有许多需要我们去注意的,今天就和大家介绍下实验中常见的标曲和样本的显色问题。

一、标曲不显色或显色很弱,样本显色。

   溶解标准品以及倍比稀释时,未涡旋震荡或不够充分。标准品溶解时,需要涡旋震荡,以保证充分溶解。在做倍比稀释时,也要涡旋震荡以保证充分混匀。单纯依靠移液器反复吹打,效率较低、效果也不一定好。

二、标曲和样本均不显色。

   在孵育阶段静置在桌面上,这样非常不利于抗原抗体之间的充分接触,导致显色偏弱。推荐孵育阶段,使用ELISA专用的微孔板振荡器,调至合适的频率,使抗原抗体充分接触,保证结合效果。

   如果排除上述原因,有可能是漏加了某个组分,如检测抗体、酶等。所以在实验过程中,一定要做好标记和记录,或者使用添加染料的ELISA试剂盒。

三、标曲显色,样本不显色。

   到这种情况,很多人觉得是试剂盒问题,这其实是一个误区。任何一种实验方法,都有其局限性,当样本中目的蛋白浓度极低或者样本中干扰因素较强,就无法检测到。目前ELISA仍然是蛋白检测灵敏度的方法,与不同技术结合后,衍生出了多种类型的ELISA,提高了检测灵敏度。如采用信号增强剂的高敏ELISA、ECL为底物的化学发光ELISA、采用荧光法检测的ELISA、结合PCR扩增的免疫PCR等等。

   对于目的蛋白浓度特别低的样本,可以尝试用高敏ELISA,但这也并不意味着一定能检测到样本浓度,只能说可以提高样本的可测率,并使结果更加可靠。因为通常用普通ELISA检测的样本OD值都偏低,甚至低于标准品浓度的S7点,虽然可以计算得到数值,但实际上这个数值的可信度已经降低了。而高敏ELISA可提高样本OD值,使之尽量位于标曲范围内,得到的数值也更加可信。

四、标曲和样本都显色,但复孔的CV大。

   这个问题就跟移液器和实验者的操作有关了。移液器的使用维护不规范,就会造成移液的误差较大。实验者自身的操作习惯、加样的一致性对复孔的CV也有很大影响。个人的操作可以在空白板上练习移液动作,或者在几十个离心管中加入相同体积的水,通过电子天平称量,检验移液的精密度。同时还需练习加快加样速度,减少从个样本到后一个样本加样时间过长导致的差异。

   ELISA实验中有关标曲和样本的显色问题主要就是以上4种,当然还会存在其他的问题,在这里就不一一介绍了,大家在操作过程中要细心谨慎,防止出现以上的问题。

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