ELISA试剂盒科研实验中的操作技巧与注意事项

在Elisa试剂盒检测实验中，包被原的性质很重要，蛋白浓度，是否降解，这关系到你做出的抗体可不可以被其识别，所以保留抗原很重要，做重组蛋白时，要在冰浴下缓慢融化就是这个道理。封锁就是让大量不相关的蛋白质充填这些旷地空闲，从而排斥Elisa后的步骤中干扰物质的再吸附。但有时因为试验的需要，包被原的特殊性也可能采用中性的缓冲溶液来包。

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。该法适于测定细胞培养上清、血清、血浆及组织液中的样本，干扰小可以测到每毫升纳克水平的细胞因子(或受体)的水平。

操作技巧：

1.加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。

2.合理安排检测量，以免反应板过多造成洗板等待时间长。

3.吸取液体时，要用量程和需要量接近的枪去吸，减少误差。

4.要尽量做双孔实验，这样才既能保证数据的准确性，又能反映出试剂盒的精密度。

5.样品稀释液应用加液器加注，并经常校对其准确性。

6.为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。

7.未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。辣根过氧化物酶标记抗人IgG工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的辣根过氧化物酶标记抗人IgG工作液。

8.ELISA试剂盒实验中，加样后及时放人孵箱，标本较多时，要分批操作。按说明步骤严格控制操作时间，防止孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。

9.剩余样品及废弃物应经121℃高压蒸汽灭菌30分钟，或用5.0g/L次氯酸钠等消毒剂处理30分钟后废弃。

10.人ELISA试剂盒洗涤时各孔均需加满液体，防止孔口有游离酶不能洗净。

11.每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是加底物溶液及2N H2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。

12.手工洗板时每次加入洗涤液后。应静置15～30s，不要将一个酶标孑L中的洗涤液溅入另一酶标孔中，防止交叉污染。甩去洗涤液后将酶标板放在毛巾或吸水纸上拍干。

13.对样本的结果有疑问时需要使用其他检测方法进行验证。

14.没有去离子水或双蒸水时，可以使用娃哈哈纯净水配制溶液，切勿使用自来水。

15.在使用微量加样器时，吸取不同瓶子中液体后要更换枪头，即使吸取标准品溶液。

16.吸取液体时速度不易太快，以免产生气泡，人ELISA试剂盒吸取的量不够准确。

17.吸取液体时要选用量程和需要量接近的微量加样器吸，减少误差。

注意事项：

1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20 分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。

2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封(低温干燥)保存。

3.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

4.所有液体组分使用前充分摇匀。

按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。

试剂盒的配制：对于每种细胞因子应仔细阅读说明书，注意每批的细节。在使用细胞因子前，瞬时离心试剂瓶，尽可能多地收回其中的细胞因子。根据每批说明书中的细节，将冻干的细胞因子复溶。一般待测抗原标准曲线的线性范围的可通过将标准品做8次2倍系列稀释从2000pg/ml到15pg/ml。可利用标准的ELISA操作流程、放大试剂盒、第三类试剂、或改变酶底物系统可在一定范围内提高灵敏度。为了优化灵敏度，建议孵育标准品和标本。若使用过氧化物酶作为显色系统，应严禁在洗液和稀释液中加叠氮钠，叠氮钠可抑制过氧化物ELISA试剂盒酶的活性。

试剂盒的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式点。

洗板方法：

手工洗板，吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。自动洗板，如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。